Real-time fluorescentie kwantitatieve PCR is een methode voor het meten van de totale hoeveelheid product na elke polymerasekettingreactie (PCR)-cyclus in een DNA-amplificatiereactie met behulp van een fluorofoor.De methode wordt gebruikt om specifieke DNA-sequenties in het te testen monster te kwantificeren met interne of externe referentiemethoden.Sinds het begin zijn fluorescerende kwantitatieve PCR-assays steeds populairder geworden bij laboratoriumdocenten.
Fluorescentie-PCR-principe: Fluorescentie-PCR, eerst TaqManPCR genoemd en later ook Real-TimePCR, is een nieuwe kwantificeringstechniek voor nucleïnezuur die in 1995 door PE (PerkinElmer) in de VS is ontwikkeld. De techniek is gebaseerd op de toevoeging van een fluorescent gelabelde probe of overeenkomstige fluorescerende kleurstof naar conventionele PCR om zijn kwantitatieve functie te bereiken.Het principe: naarmate de PCR-reactie vordert, accumuleren de PCR-reactieproducten en neemt de intensiteit van het fluorescentiesignaal in gelijke verhouding toe.Bij elke cyclus wordt een fluorescentie-intensiteitssignaal verzameld, zodat we de verandering in producthoeveelheid kunnen volgen door de verandering in fluorescentie-intensiteit en zo een fluorescentie-amplificatiecurvegrafiek verkrijgen.
In het algemeen kan de fluorescentie-amplificatiecurve worden onderverdeeld in drie fasen: de fluorescentie-achtergrondsignaalfase, de fluorescentiesignaal-exponentiële amplificatiefase en de plateaufase.Tijdens de achtergrondsignaalfase wordt het versterkte fluorescentiesignaal gemaskeerd door het fluorescentieachtergrondsignaal en kunnen veranderingen in producthoeveelheid niet worden bepaald.In de plateaufase neemt het amplificatieproduct niet langer exponentieel toe, is er geen lineair verband tussen de hoeveelheid eindproduct en de hoeveelheid starttemplate, en kan het start-DNA-kopieaantal niet worden berekend op basis van de uiteindelijke PCR-producthoeveelheid.Alleen in de exponentiële amplificatiefase van het fluorescentiesignaal is er een lineair verband tussen de logaritme van de hoeveelheid PCR-product en de hoeveelheid starttemplate, en we kunnen ervoor kiezen dit in dit stadium te kwantificeren.Voor het gemak van kwantificering en vergelijking zijn twee zeer belangrijke concepten geïntroduceerd in de real-time fluorescente kwantitatieve PCR-techniek: de fluorescentiedrempel en de CT-waarde.
De drempel is een kunstmatig ingestelde waarde op de fluorescentie-amplificatiecurve.exponentiële fase van PCR-amplificatie.
Ct-waarde: is het aantal cycli dat het fluorescentiesignaal in elk reageerbuisje heeft ondergaan om de ingestelde domeinwaarde te bereiken.
De relatie tussen de Ct-waarde en de startsjabloon: studies hebben aangetoond dat de Ct-waarde van elke sjabloon een lineaire relatie heeft met de logaritme van het startkopienummer van die sjabloon, hoe meer kopieën van het startkopienummer, hoe kleiner de Ct waarde.De Ct-waarden zijn relatief stabiel.Een standaardkromme kan worden gemaakt met behulp van een standaard met een bekend startkopienummer, waarbij de horizontale coördinaat de logaritme van het startkopienummer voorstelt en de verticale coördinaat de Ct-waarde zoals weergegeven in onderstaande figuur.
Door de Ct-waarde van een onbekend monster te verkrijgen, kan daarom het aantal startkopieën van dat monster worden berekend uit de standaardcurve.
De Ct-waarde is niet constant en kan worden beïnvloed door verschillende samples en verschillende instrumenten, zelfs als hetzelfde sample 2 keer wordt herhaald op hetzelfde instrument, kan de Ct-waarde variëren.
Kwantitatieve fluorescentietests: Kwantitatieve fluorescentietests kunnen worden onderverdeeld in fluorescerende probes en fluorescerende kleurstoffen, afhankelijk van de gebruikte markers.Fluorescerende sondes omvatten Beacon-technologie (moleculaire bakentechnologie, vertegenwoordigd door American Tagyi), TaqMan-sondes (vertegenwoordigd door ABI) en FRET-technologie (vertegenwoordigd door Roche);fluorescerende kleurstoffen omvatten verzadigde fluorescerende kleurstoffen en niet-verzadigde fluorescerende kleurstoffen, de typische vertegenwoordiger van niet-verzadigde fluorescerende kleurstoffen is SYBRGreen I, dat nu vaak wordt gebruikt;verzadigd De typische vertegenwoordiger van niet-verzadigde fluorescerende kleurstoffen is SYBRGreenⅠ;verzadigde fluorescerende kleurstoffen zijn EvaGreen, LCGreen, enz.
SYBRGreenI is een veelgebruikte DNA-bindende kleurstof voor fluorescente PCR, die niet-specifiek bindt aan dubbelstrengs DNA.In zijn vrije staat zendt SYBRGreenI een zwakke fluorescentie uit, maar eenmaal gebonden aan dubbelstrengs DNA, neemt zijn fluorescentie 1000-voudig toe.Daarom is het totale fluorescentiesignaal dat door een reactie wordt uitgezonden evenredig met de hoeveelheid dubbelstrengs DNA die aanwezig is en neemt toe naarmate het amplificatieproduct toeneemt.
Voordelen van dubbelstrengs DNA-bindende kleurstoffen: eenvoudig experimenteel ontwerp, slechts 2 primers nodig, geen behoefte om sondes te ontwerpen, geen behoefte om meerdere sondes te ontwerpen voor het snel testen van meerdere genen, mogelijkheid om smeltpuntcurve-analyse uit te voeren, test de specificiteit van de versterkingsreactie, lage initiële kosten, goede algemeenheid en daarom vaker gebruikt in onderzoek in binnen- en buitenland.
Fluorescerende probe-methode (Taqman-techniek): wanneer PCR-amplificatie wordt uitgevoerd, wordt een paar primers toegevoegd samen met een specifieke fluorescente probe.Wanneer de sonde intact is, wordt het fluorescentiesignaal dat wordt uitgezonden door de reportergroep geabsorbeerd door de gedoofde groep en niet gedetecteerd door het PCR-instrument;tijdens PCR-amplificatie (in de verlengingsfase) degradeert de 5'-3'-splitsingsactiviteit van het Taq-enzym de probe enzymatisch, waardoor de reporterfluorescentiegroep en de gedoofde fluorescentiegroep
Toepassingen van fluorescerende kwantitatieve PCR.
Moleculair biologie onderzoek:
1. Kwantitatieve nucleïnezuuranalyse.Kwantitatieve en kwalitatieve analyse van infectieziekten, detectie van pathogene micro-organismen of virussen, zoals de recente influenza A (H1N1) epidemie, detectie van genkopie-aantallen van transgene planten en dieren, detectie van RNAi-geninactiveringspercentages, enz.
2. Differentiële genexpressieanalyse.Vergelijking van genexpressieverschillen tussen behandelde monsters (bijv. medicamenteuze behandeling, fysieke behandeling, chemische behandeling, enz.), expressieverschillen van specifieke genen in verschillende fasen en bevestiging van cDNA-microarray- of differentiële expressieresultaten
3. SNP-detectie.De detectie van single nucleotide polymorfismen is belangrijk voor de studie van individuele gevoeligheid voor verschillende ziekten of individuele respons op specifieke medicijnen, en vanwege de ingenieuze structuur van moleculaire bakens is het, zodra de sequentie-informatie van een SNP bekend is, gemakkelijk en nauwkeurig om gebruik deze techniek voor SNP-detectie met hoge doorvoer.
4. Methyleringsdetectie.Methylering wordt geassocieerd met veel menselijke ziekten, vooral kanker, en Laird rapporteerde een techniek genaamd Methyllight, die DNA behandelt voorafgaand aan amplificatie, zodat niet-gemethyleerd cytosine uracil wordt en gemethyleerd cytosine niet wordt aangetast, met behulp van specifieke primers en Taqman-sondes om onderscheid te maken tussen gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA .gevoeliger.
Medisch onderzoek:
1. Prenatale diagnose: mensen kunnen erfelijke ziekten veroorzaakt door veranderd genetisch materiaal niet behandelen, en tot nu toe kunnen ze het aantal zieke baby's dat geboren wordt alleen verminderen door prenatale monitoring om het optreden van verschillende erfelijke ziekten te voorkomen.Dit is een niet-invasieve methode die gemakkelijk wordt geaccepteerd door zwangere vrouwen.
2. Pathogeendetectie: de fluorescente kwantitatieve PCR-test maakt kwantitatieve bepaling mogelijk van pathogenen zoals gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, humaan papillomavirus, herpes simplex-virus, humaan immunodeficiëntievirus, hepatitisvirus, influenzavirus, Mycobacterium tuberculosis, EBV en cytomegalovirus.Het heeft de voordelen van een hoge gevoeligheid, een kleine steekproefomvang, snelheid en eenvoud in vergelijking met traditionele testmethoden.
3. Beoordeling van de werkzaamheid van geneesmiddelen: kwantitatieve analyse van het hepatitis B-virus (HBV) en het hepatitis C-virus (HCV) toont aan dat de relatie tussen de virale belasting en de werkzaamheid van bepaalde geneesmiddelen.Als de serumspiegel van HBV-DNA daalt tijdens de behandeling met lamivudine en vervolgens weer stijgt of het vorige niveau overschrijdt, is dit een aanwijzing voor een virusmutatie.
4. Oncogenetische testen: Hoewel het mechanisme van tumorontwikkeling nog niet duidelijk is, wordt algemeen aanvaard dat mutaties in relevante genen de onderliggende oorzaak zijn van oncogene transformatie.Verhoogde expressie en mutatie van oncogenen is te zien in de vroege stadia van veel tumoren.Real-time fluorescentie kwantitatieve PCR is niet alleen effectief bij het detecteren van mutaties in genen, maar kan ook nauwkeurig de expressie van oncogenen detecteren.Deze methode is gebruikt om de expressie van een verscheidenheid aan genen te detecteren, waaronder het telomerase hTERT-gen, het chronische granulocytische leukemie WT1-gen, het oncogene ER-gen, het prostaatkanker PSM-gen en tumor-geassocieerde virale genen.
Vertaald met www.DeepL.com/Translator (gratis versie)
Posttijd: 21 juni-2022